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2×CTAB法植物總DNA提取

2×CT AB法植物總DNA提取

1. 液氮研磨1g左右的植物組織,轉移到離心管中。改用研磨槍在冰上研磨,不加β-巰基乙醇

研磨時可加入適量的PVP、β-巰基乙醇。若CTAB準備2-3天內用完,則可將PVP、β-巰基乙醇直接加入其中。

2×CTAB法植物總DNA提取

2. 加入500μl的2*CTAB (60℃或65℃預熱) ,顛倒混合均勻后在60℃或65℃水浴30m-1h 小時,其間要上下顛倒混勻數次。

3.取出離心管,加入等體積的24:1(三氯甲烷:異戊醇),上下顛倒充分混合。

若量多,則可以直接側立于搖床上晃動10分鐘。

4.12000轉速離心5-10min。將離心管動作輕緩的取出轉子,放置于離心管架上。

a.離心后溶液分三層:上層為水相;中層為碎片和蛋白相;底層為氯仿

b.迅速進入下一步,以免各相混合

5.用移液槍吸取管中上層水相,動作一定要輕緩,不可攪動其它兩層。

a.此步驟要寧舍不貪多,盡量避免吸取到下層液體。

b.若上步驟中中間層較厚,則繼續加入等體積24:1,再次抽提一次,直至中間層較薄。

6.在抽提出的水相中加入1/3體積的5M的KAc及等體積的異丙醇(4℃預冷),輕輕晃動混合均勻后在-20℃沉淀。沉淀至少15分鐘至過夜。

6-1 在抽提出的水相中加入1/10體積醋酸鈉(pH5.2, 3M),混勻后,加入2倍體積預冷的無水乙醇,-20℃沉淀15min至過夜。

6-3. 在抽提出的水相中加入加入2倍體積預冷的無水乙醇,-20℃沉淀15分鐘至過夜。

a.時間越長,DNA的產量越多,污染也越多

7. 12000轉速離心5-10min,去上清,倒置于吸水紙上數分鐘,加入700μl 70%的酒精,上下顛倒數次,洗滌沉淀。12000轉離心5-10
m,去上清,倒置于吸水紙上數分鐘。重復一遍。

7. 12000轉速離心5-10min,去上清,倒置于吸水紙上數分鐘,加入700μl 70%的酒精,上下顛倒數次,洗滌沉淀。12000轉離心5-10m,去上清,倒置于吸水紙上數分鐘。重復一遍。

8. 12000轉速離心5-10min,去上清,倒置于吸水紙上數分鐘,最后置于超凈工作臺中吹干。

9. 在離心管中加入30-50μl的滅菌去離子水或者TE溶液,4℃放置數小時,使其充分溶解。

10.用瓊脂糖凝膠檢測結果。

11. -20℃—— -70℃低溫保存。

去除總DNA中的 RNA污染先做預擴增實驗,若RNE污染無嚴重影響則舍去該步驟

A

1. 在總DNA溶液中加入滅菌去離子水或者TE溶液調整總體積至200μl, 加入10μRNase-A (10mg/ml)4℃過夜,或者37℃ 1h .

2. 用等體積的24:1抽提。

3. 沉淀DNA——洗滌DNA——干燥DNA——溶解DNA—— -20℃—— -70℃低溫保存。

B 直接加入10μRNase-A(10mg/ml)后冷凍保存。

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